PCR – Polymerase-Kettenreaktion
Replikation im Reagenzglas
Die PCR (Polymerase-Kettenreaktion engl.: Polymerase-Chain-Reaktion) ist ein Laborverfahren, um DNA-Fragmente im Reagenzglase zu vervielfältigen.
Zutaten:
· DNA-Probe mit der zu vervielfältigenden DNA
· DNA-Nucleotide (A T G C)
· Primer
· Thermostabile DNA-Polymerase (TAQ-Polymerase)
· Pufferlösung (hält den pH-Wert stabil)
Denaturierung: Zunächst wird die doppelsträngige DNA auf ca. 95 °C erhitzt, um die Stränge zu trennen. Die Wasserstoffbrückenbindungen, die die beiden DNA-Stränge zusammenhalten, werden aufgebrochen.
Primerhybridisierung (primer annealing): In diesem Schritt wird die Temperatur abgesenkt und ca. 30 Sekunden lang auf einem Wert gehalten, der eine spezifische Anlagerung der Primer an die DNA erlaubt. (z.B. 60 °C)
Elongation (Polymerisation, Amplifikation): Die DNA-(Taq)-Polymerase ergänzt die fehlenden Nucleotide beginnend am 3'-Ende des angelagerten Primers (72 °C).
Hier geht es zu einem Artikel in der Wikipedia.
Hier ist ein Video von the simple biology
Telekolleg Biologie: Anwendungen der Gentechnik
Genetischer Fingerabdruck
Anwendungsbereich:
Kriminalistik: Täterbestimmung
Vaterschaftsnachweis
Vorgehensweise:
Hier ist eine gut verständliche Erklärung
Gelelektrophorese
Die Gelektrophorese ist ein Trennungsverfahren für Moleküle z.B. DNA-Fragmente in einem Gel, an das ein elektrisches Feld angelegt wird.
Dabei wandern kleine (kurze) Moleküle schneller als große (langkettige).
Somit ergibt sich ein charakteristisches Bandenmuster.
Hier ist eine gute Erklärung mit Bild
DNA-Sequenzierung nach Sanger
(Kettenabbruch-Methode)
Hier ist der ganze Artikel zu Sanger
Hier ist ein Stop-Motion-Video dazu
Moderne Methoden der Sequenzierung
Heute verwendet man vorwiegend voll automatisierte Methoden zur DNA-Sequenzierung, die in hoher Geschwindigkeit die Basensequenz analysieren (z.B. Hochdurchsatzsequenzierung)
Eine alternative Methode ist der DNA-Chip (DNA-Mikroarray)
Gentechnik
Klassische Gentechnik: Gene von Lebewesen unterschiedlicher Arten werden „verpflanzt“.
Neue Gentechnik: Genome Editing: Gezielte Änderungen in bestimmten Abschnitten des Erbgutes (der DNA).
Anwendungsbereiche der Gentechnik
o Grüne Gentechnik: Gentechnik mit Pflanzen
o Rote Gentechnik: Anwendungen im medizinischen Bereich
o Gentherapie: Therapie (Behandlung von Krankheiten) mit Hilfe von
Gentechnik
somatische Gentherapie: Körperzellen werden gentechnisch „repariert“.
Keimbahntherapie: Keimzellen bzw. deren Vorläuferzellen werden gentechnisch verändert (in Deutschland verboten)
o Weiße Gentechnik: Gentechnik für Waschmittel und Lebensmitteltechnologie
Restriktionsenzyme als genetische Scheren
mehrere bekannt
schneiden nach 4-8 bestimmten Nucleotiden
es entstehen „sticky ends“
Plasmid: Ring bakterieller DNS, werden von Bakterien „freiwillig“ ausgetauscht bzw. aufgenommen
in das Plasmid wird das gewünschte Gen integriert
zusätzlich zur Kontrolle ein Gen(en) zur Antibiotika-Resistenz (z.B.
gegen Tetracyclin / Ampicillin
Vorteil: Bakterien sind schnell und einfach zu kultivieren
Nachteil: Unterschiede zur eukaryontischen Molekulargenetik
schränken die Einsatzmöglichkeiten ein.
Beispiel: Insulinproduktion
Methoden des Gentransfers (für unterschiedliche Zielzellen)
· Viren
· Agrobakterium
· Mikroinjektion
· Partikelpistole
· Elektroporation
· Lipofektion
· Calciumphosphat-Präzipitation
Verschiedene Methoden des Gentransfers:
a. Bakterien werden dann „kompetent“ gemacht, d.h. die Membran wird
durchlässig gemacht (Calciumchlorid)
bei Eukarontischen Zellen: Calciumphosphat-Präzipitation (Fremd- DNA wird in die Kristalle eingelagert und durch Endocytose aufgenommen.
b. Lipofektion (bei Eukaryonten): Verpackung in Liposomen
c. bei Pflanzen: Agrobakterium tumefaciens
löst normalerweise durch sein tumor inducing plasmid (Ti-Plasmid) Wurzelhalsgallen aus
Nachteil: Befällt nur Dikotylen (keine Gräser, Getreide, Mais)
d. Biolistik: „DNA-Kanone“ mit DNA-beschichteten Metallkügelchen
e. Mikroinjektion (bei Säugetieren)
f. Viren (vor allem bei Tieren bzw. Menschen (Gentherapie))
Gentechnik bei Pflanzen (Grüne Gentechnik)
Hier ist ein Artikel zur Grünen Gentechnik
Anti-Matsch-Tomate näher betrachtet
· Der Fäulnisprozess der Tomate wird durch ein Enzym, eine Pektinase, beschleunigt.
· Ziel war es also die Pektinase zu hemmen.
· Dafür greift man in die Proteinbiosynthese ein, die m-RNA wird blockiert durch eine komplementäre antisense-mRNA
· Diese konnte man erzeugen, indem man ein dazu passendes antisense Gen als cDNA ins Genom der Zelle eingeschleust.
· Dieses antisense-Gen wird dann in der Zelle transkribiert, wobei die Anti-Sense-mRNA entsteht welche wiederum die mRNA für das Pektinase-Enzym blockiert, indem sich beide aneinander lagern
Gentechnik bei Tieren
· Erzeugung von transgenen Zygoten durch Mikroinjektion
· Einbau des Fremdgens erfolgt zufällig!
· Tiere als Modellorganismen für die Medizin am Menschen: Gezieltes Ausschalten von Genen im Knock-out-Verfahren
Gentechnik mit tierischen Zellkulturen
· Beispiel CHO-Zellen
(chinese-hamster-ovar)
dienen zur Herstellung von Blutgerinnungsfaktor VII oder EPO
· m-RNA wird aus menschlichen Zellen gewonnen, daraus cDNA hergestellt und in ein Plasmid eingebaut.
· dieses wird in CHO-Zellen transformiert
Nahrungsmittel und Gentechnik
Tomaten, Soja, Mais, Kartoffeln
Verordnung zur Kennzeichnung seit 2004
Gentechnisch gewonnene Enzyme sind nicht
kennzeichnungspflichtig! (=> Käseherstellung)
Gentechnik in der Diskussion
Gefahr der Allergien (es werden häufig andere Proteine gebildet)
ökologische Bedenken: Freisetzung gentechn. veränderter
Pflanzen/Tiere bringt umkalkulierbares Risiko mit sich
ethische Bedenken („Pfuschen“ an der Schöpfung)
Gentechnik in der Medizin (Rote Gentechnik)
Gentherapie
Somatische Gentherapie
Keimbahntherapie
Strategien
· Substitution des defekten Gens
· Hemmung eines Fremdgens
· Lokale Genexpression (bei polygenen Erkrankungen)
Methoden des Gentransfers
· Ex-vivo-Verfahren: außerhalb des Organismus (entnommene Zellen werden gentherapeutisch behandelt)
· In-vivo-Verfahren: Zellen im Körper werden
gentherapeutisch behandelt
Viren als Vektoren
Der große Durchbruch steht noch aus!
Erklärvideo Gentherapie mit Artikel
Artikel: Gentherapie - Hartnäckige Probleme gefährden den Erfolg
CRISPR/Cas 9: Die programmierbare Genschere
Eine neue Methode revolutioniert die Gentechnik
Mit Crispr lässt sich DNA gezielt schneiden und verändern. So können Gene eingefügt, entfernt oder ausgeschaltet werden. Das funktioniert bei einzelnen Basen und ganzen Genabschnitten, auch an mehreren Stellen zugleich.
Hier ist ein Artikel aus Spektrum der Wissenschaft
Hier ist eine Seite von planet wissen mit Filmsequenzen
Hier ist ein Artikel: Wie funktioniert CRISPR-CAS9 ?
Erklärvideo zu Crispr-Cas9 von der Max Planck Gesellschaft
Genregulation in der Natur
Genregulation
· Konstituive Gene werden immer abgelesen, sind immer aktiv
Beispiel: Gene für die Enzyme der Glykolyse
· Regulierte Gene werden nur „bei Bedarf“ aktiviert
Genregulation bei Bakterien: Operon-Modell
Promotor: Anlagerungsstelle für RNA-Polymerase
Operator: Kontrollabschnitt
Strukturgene: codieren die notwendigen Enzyme
Funktionsweise des Lactose-Operon
(häufig bei Abbaureaktionen)
Normalerweise blockiert der Repressor den Operator => Gene inaktiv
Lactose gelangt in die Zelle
à wirkt als Effektor und bindet an den Repressor
à Repressor verändert Raumstruktur, löst sich ab
à RNA-Polymerase kann andocken und die Transkription ablaufen
àüber die Translation werden die notwendigen Enzyme hergestellt.
ð Lactose wird abgebaut, schließlich auch das als Effektormolekül fungierende Lac-Molekül
ð Repressor verändert wieder Raumstruktur, dockt wieder an Operator an
ð Transkription wird gestoppt.
Tryptophan-Operon
(häufig bei Synthesen)
Funktioniert genau „anders herum“:
Hier ist der Repressor normalerweise inaktiv, die Synthese läuft.
Wird kein trp mehr gebraucht, reichert es sich in der Zelle an
à wirkt als Effektor und aktiviert den Repressor
è Synthese stoppt
Regulation der Genaktivität bei Eukaryonten
1. Möglichkeit: Transkription wird gesteuert (erleichtert / erschwert / verhindert)
Methylierung erschwert die Transkription
Acetylierung erleichtert die Transkription
Beide Mechanismen spielen eine Rolle bei dem Einfluss von Umweltfaktoren (Epigenetik)
Transkriptionsfaktoren wirken erschwerend (silencer) oder fördernd (enhancer).
z.B. über Hormone
2. Möglichkeit: Ansatz beim Processsing
z.B. alternatives Spleißen
3. Möglichkeit: Erleichterung / Verhinderung der Translation
z.B. RNA-Interferenz
RNA-Interferenz
Die RNA-Interferenz (RNA-Silencing) ist ein natürlicher Mechanismus zur zielgerichteten Abschaltung von Genen.
Im Gegensatz zur Methylierung und (De)Acetylierung der DNS setzt die RNA-Interferenz an der „fertig“ gebildeten m-RNA an.
Diese wird durch kurze komplementäre RNA-Stücke (mi-RNA oder si-RNA) blockiert und schließlich zerlegt, so dass keine Translation stattfinden kann.
Bildung der micro-RNA (mi-RNA):
· Durch Transkription entsteht zunächst eine prä-mi-RNA)
· Diese faltet sich => doppelsträngig
· wird zurecht geschnitten durch DICER (einen Enzymkomplex)
· Analog wird auch die small interfering RNA (si-RNA) z.B. bei einem Virusbefall von DICER geschnitten.
Mechanismus der RNA-Interferenz:
· Enzymkomplex trennt die doppelsträngige mi-RNA oder si-RNA auf und heftet sich an einen der Stränge => RISC-Komplex
· dieser bindet dann komplementär an eine „normale“ m-RNA im Zellplasma, verhindert deren Translation oder erschwert sie, die RNA wird abgebaut.
Epigenetik -
Der Einfluss von Umweltfaktoren auf unsere Gene
Heute weiß man, dass Umweltfaktoren auf Auswirkungen auf die Gene haben können, genauer gesagt auf die Steuerung von Genen. Diese Veränderungen können auch vererbt werden.
Hier ist ein Artikel von planet-wissen.
Möglichkeit 1: Acetylierung / Deacetylierung der Histone
Die DNS ist um die Histone (Proteine) gewickelt (Kondensierung). Kondensierte DNS kann nicht abgelesen (transkribiert) werden.
Durch Enzyme werden nun an bestimmte Aminosäuren Acetylgruppen angehängt (Acetylierung) bzw. entfernt (Deacetylierung). Die Acetylierung verhindert, dass sich die DNS besonders dicht gepackt ist. Die Transkription kann leichter ablaufen.
Hier ist eine Animation der Acetylierung und Deacetylierung.
Möglichkeit 2: Methylierung der DNS
Hier hängen Enzyme (Methyltransferasen) hängen eine Methylgruppe eine der Basen (vorrangig Cytosin). Dadurch ändert sich die Raumstruktur, die Transkription wird unterbunden.
Hier ist eine Animation der Methyilerung.
Hier ist ein kurzer Erklärfilm
Campus Doku: Können Traumata vererbt werden?
Hier ist ein guter Animationsfilm der Max-Planck-Gesellschaft über die Epigenetischen Mechanismen
Kommen wir jetzt zur Proteinbiosynthese. Nach der ein-Gen-ein-Enzym-Hypothese bezeichnet man den Abschnitt auf der DNA, der ein Protein - bzw. ein Enzym - codiert, als ein Gen.
Die Proteinbiosynthese besteht dann aus zwei Schritten, der Transkription und der Translation.
Hier geht es zu den Erklärfilmen von the simple Biology: Transkription , Processing , Translation
Hier sind die entsprechenden Artikel aus der Wikipedia zur
Transkription Translation Prozessierung der RNA bei Eukaryonten
Codesonne
Die Codesonne hilft bei der "Übersetzung" des genetischen Codes. Hier sind die Basentripletts der m-RNA
von 5' nach 3' von innen nach außen dargestellt.
Hier ist eine Codesonne der Wikipedia
Der genetische Code
Hintergrund:
· Proteine bestehen aus Aminosäuren.
· Diese sind in einer bestimmten Reihenfolge
miteinander verknüpft
(Primärstruktur: Aminosäure-Sequenz)
· Die Reihenfolge der Aminosäuren ist in der Basenabfolge der DNA bzw. m-RNA codiert.
Ein Basentriplett (3 Basen) codiert jeweils eine Aminosäure.
Eigenschaften des genetischen Codes:
· kommafrei (Es gibt keine Leerstellen)
· nicht überlappend
· degeneriert (redundant): Man kann nicht eindeutig von der Aminosäuresequenz auf die Basensequenz schließen, da die meisten Aminosäuren durch mehrere Basentripletts codiert werden.
· universell (gilt für alle Lebewesen)
Translation
Bei der Translation wird die Basenabfolge auf der m-RNA in eine Aminosäurenabfolge (Aminosäuresequenz vgl. Primärstruktur) übersetzt.
Ort: Ribosomen im Cytoplasma (bzw. am eR)
1. Initiation (START)
· m-RNA bindet an die kleine Untereinheit des Ribosoms
· t-RNA mit einem Anticodon passen zur Startstelle (AUG) auf der m-RNA bindet an der P-Stelle an (trägt die Aminosäure MET)
· große Untereinheit dockt an
2. Elongation (Kettenverlängerung)
· Nächste t-RNA mit passendem Anticodon dockt an die A-Stelle an
· Aminosäuren werden durch Peptidbindung miteinander verbunden.
· Ribosom rückt auf der m-RNA um eine Position weiter (z.B. von A- zur P-Stelle).
· erste t-RNA befindet sich nun an der E-Stelle und verlässt das Ribosom
· Nächste t-RNA mit passendem Anticodon dockt an die A-Stelle an. Usw.
3. Termination
· Ribosom trifft auf STOPP-Codon
· Translation stoppt, keine weitere Aminosäure wird gebunden
· Ribosom zerfällt in seine 2 Untereinheiten
· Aminosäurekette wird freigesetzt und nimmt ihre
räumliche Struktur ein
(Sekundär-, Tertiärstruktur bildet sich aus)
Mutationen sind zufällige Veränderungen des Erbguts. Grob unterscheidet man
Wenn ein Gen mutiert ist, wird häufig kein funktionierendes Enzymmolekül gebildet.
Hier ist eine genauere Auflistung der verschiedenen Mutationstypen: